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Das HPLC Verfahren basiert darauf, das ein zu untersuchender Stoff zusammen mit einem Laufmittel, auch mobile Phase genannt, durch eine stationäre Phase gepumpt wird. Die beiden Phase befinden sich zusammen in einer Trennsäule. Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der Stationären Phase, verbleibt er länger in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der stationären Phase, verlässt er die Säule früher. Schließt man der ersten Auftrennung eine Zweite an, kann man das Auflösungsvermögen noch einmal deutlich steigern. So können Peaks aus dem ersten HPLC, die in Wirklichkeit aus mehreren Peaks zusammen gesetzt sind, in einem zweiten Durchlauf in mehrere Peaks zerlegt werden. Das Vorgehen bezeichnet man dann als eine 2D-HPLC. Das Auflösungsvermögen liegt unter dem der Gelelektrophorese, die Reproduzierbarkeit ist jedoch leichter zu erreichen.