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Eine effiziente Methode zur DNA Sequenzierung ist die Kettenabbruchmethode auch Didesoxymethode genannt. Sie erlaubt die Squenzierung von DNA-Fragmenten mit mehreren hundert Nukleotiden. DNA-Polymerase ist dabei das Enzym das die Sequenzierung ermöglicht, deshalb gehört die Kettenabbruchmethode zu den enzymatischen Sequenzierungsverfahren. Das Verfahre Basiert auf der Verwendung von Didesoxynukleosidtriphosphaten (ddNTP) zum gezielten Abbruch von DNA-Polymerisationen.

Sie unterscheiden sich von den normalerweise zur Polimerisation von DNA verwendeten desoxynukleosidtriphosphaten (dNTP) darin, dass der enthaltene Zucker nicht Desoxyribose, sondern Didesoxyribose ist. Mit anderen Worten fehlt gegenüber der Ribose an diesem Zucker nicht ein Sauerstoff Atom (wie bei der Desoxyribose) sondern zwei. Das zweite Sauerstoffatom sitzt bei der Ribose und Desoxyribose am C3' Atom und bildet dort eine OH Gruppe. Wird ein ddNTP anstatt einem dNTP bei der Kopie eines DNA-Fragmentes durch DNA-Polymerase verwendet, wird auf Grund der fehlenden OH-Gruppe die Polymerisation an diese Stelle abgebrochen.

Diesen Abbruch kann man sich zur Sequenzierung zu Nutze machen. Man setzt zunächst vier verschiedene Lösungen an, die alle DNA-Polymerase, einen zum DNA-Fragment passenden Primer und alle vier verschiedenen dNTPs (dCTP, dATP, dTTP, dGTP) enthalten. Zusätzlich gibt man in eine Lösung eine Konzentration von ddNTP mit Cytosin im Nukleosid (ddCTP); in eine andere ddNTP mit Adenin im Nukleosid (ddATP) und in die beiden verbleibenden Lösungen entsprechend jeweils ddTTP und ddGTP.

Die DNA-Polymerase beginnt nun in allen vier ansätzen die Fragmente zu polymerisieren. In jedem Ansatz wird sie jedoch bei einer bestimmten Base am Matrizenstrang mit einer von der Konzentration des jeweiligen ddNTPs abhängigen Wahrscheinlichkeit abbrechen.

Nimmt man zum Beispiel die Sequenz "GGATTC" werden in dem ddATP-Ansatz folgende Fragmente zu finden sein: CCTA, CCTAA und CCTAAG. Im ddTTP-Ansatz: CCT und CCTAAG. Im ddCTP-Ansatz: C, CC und CCTAAG. Und im ddGTP: CCTAAG. Insgesamt sind dann Fragmente jeder möglichen länge vorhanden (jedoch in verschiedenen Ansätzen):

C
CC
CCT
CCTA
CCTAA
CCTAAG

Man kann nun die Fragmente mit Hilfe von Gelelektrophorese nach ihrer Größe auftrennen, dabei benötigt man ein Gel das DNA-Sequenzen mit einem Größenunterschied von nur einer Base noch sauber auftrennen kann. Man setzt vier Laufansätze an die jeweils für A, G, T und C stehen. In dem oberen Beispiel wird die Bande die am weitesten gelaufen ist bei C zu sehen sein. Die zweit weiteste auch bei C, dann bei T, dann bei A, dann wieder bei A und dann zuletzt bei G. So kann man auf die komplementäre Sequenz der Ausgangs-DNA zurückschließen.

Heutige enzymatische Sequenzierungen werden nicht mehr mit einem Gel ermittelt. Man markiert die ddNTP-Moleküle jeweils mit einem Farbstoff um sie optisch während einer chromatographischen Auftrennung detektieren zu können. Dies läuft computergestützt und automatisiert ab.