Als glatte Enden (Blunt ends) werden Enden eines doppelsträngigen DNA-Moleküls bezeichnet an dem keine ungepaarte Baase eines Stranges über den anderen hinausreicht. Es gibt Restriktionsendonucleasen, die DNA-Moleküle so schneiden, dass zwei glatte Enden entstehen.
Durchgänge DNA-Sequenz die aus überlappenden Fragmenten ermittelt wurde. Dies geschieht bei größeren Sequenzierungsprojekten rechnergestützt.
DNA-Einzelstränge die komplementär zueinander sind, neigen zur spontanen Ausbildung eines Doppelstrang-Moleküls unter Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen. Dieser Vorgang wird auch als DNA-Hybridisierung bezeichnet und ist temperaturabhängig.
DNA-Marker sind Orte in einem Genom die in einer Population eine gewisse Varianz aufweisen. Dazu gehören RFLPs, VNTRs, STRs, SNPs und CNVs. Dies kann zur Erstellung von Genkarten oder zur Gendiagnose genutzt werden.
DNA-Sonden sind einzelsträngige DNA-Moleküle mit bekannter Sequenz die radioaktiv (z.B. mit 32P) oder enzymatisch markiert sind. Aufgrund ihrer Fähigkeit mit komplementären DNA-Sequenzen zu hybridisieren, kann eine Sequenz auf einem DNA-Molekül mithilfe einer DNA-Sonde identifiziert werden. Anwendungsbeispiele:
Sind Enden einer DNA-Sequenz die aus einer einzigen Art von Nukleotiden aufgebaut sind. Beispiel dafür ist der Poly(A)-Schwanz der in eukaryotischen Zellen im Zuge der posttranslationalen Modifikation an das 3’-Ender der prä-mRNA synthetisiert wird. In-vitro können Homopolymerschwänze an DNA-Doppelstränge mit glatten Enden angefügt werden was zur Bildung von klebrigen enden führ.
Ermöglicht die Lokalisierung von DNA-Sequenzen auf Chromosomen. Die Chromosomale DNA wird denaturiert so dass die komplementären Stränge aufschmelzen. Dies ermöglicht einer DNA-Sonde an komplementären Sequenzen zu hybridisieren und diese so nachhaltig zu markieren. Die Lokalisierung ist dann anhand der Fluoreszenzeigenschaften der Sonde möglich.
Auf dem Lamda-Phagen basierende Vektoren können in Substitutions- und Insertionsvektoren unterteilt werden. Insertionsvektoren ermöglichen das einbringen von zusätzlicher fremd-DNA an einer einzigen Schnittstelle. So können allerdings nur geringe mengen an DNA in den Vektro eingebaut werden (bis 5 kb). Substitutionsvektoren besitzen zwei Schnittstellen für Restriktionsenzyme, die ein für die Replikation unwichtiges Stück herausschneiden. Dieses entfernte Stück kann durch eine wesentlich größere Menge an DNA (bis zu 24 kb) ersetzt bzw. substituiert werden.
Kilobase ist eine Einheit für die Länge von DNA Sequenzen. Sie gibt an aus wie vielen Basen ein DNA-Molekül besteht. Eine Kilobase (kb) entspricht dabei 1000 Nukleotiden/Basen.
Als klebrige Enden (engl.: sticky ends) bezeichnet man einsträngige Fortsätze am Ende eines doppelsträngigen DNA-Moleküls. Zwei komplementäre Enden (wie sie beispielsweise bei der Behandlung mit Restriktionsendonukleasen entstehen können) neigen dazu zu hybridisieren und somit einen durchgehenden Doppelstrang zu bilden, daher sticky ends. Es wird allerdings noch eine Ligase benötigt um die enden der Einzelstränge kovalent zu verknüpfen.
Als Klonierung bezeichnet man den Vorgang, bei dem eine beliebige DNA-Sequenz in einen Vektor (z.B. Plasmid, Phage) eingebracht wird. Dies geschieht meist um mit Hilfe des erstellten Vektors ein Transgen in einen Organismus einzuschleusen.
Enzymatische Verknüpfung des 3’-Hydroxy-Endes eines Nukleotids mit dem 5’-Phospat-Ende eines anderen Nukleotids. Nach der Hybridisierung von klebrigen Enden eines Vektor-Moleküls mit einem zu klonierenden Gen wird beispielsweise Ligase benötigt um die beiden entstandenen Lücken kovalent zu schließen (Ligation).
Linker sind DNA Fragmente, die an einen DNA-Doppelstrang mit glatten Enden angefügt werden können um so klebrige Enden zu erzeugen. Sie bestehen aus kurzen bekannten Sequenzen mit glatten Enden sowie einer Schnittstelle für ein Restriktionsenzym. Nach dem anfügen der Linker und der Behandlung mit dem entsprechenden Restriktionsenzym ergeben sie klebrig Enden.
Adapter sind kurze DNA-Fragmente mit bekannter Sequenz, die ein klebriges und ein glattes Ende besitzen. Sie werden an DNA-Sequenzen ligiert um sie mit definierten klebrigen Enden auszustatten. Durch die Modifikation der klebrigen enden der Adapter kann verhindert werden, dass sie nach einer dimerisierung durch Ligase verknüpft werden. Dies verhindert das erneute entstehen von glatten Enden durch dimerisierte Adapter.
Kurze, nicht-codierende DNA-Sequenzen die sich oft in dem Genom eines Organismus wiederholen. Sie können Ursache für Restriktionslängen Polymorphismen (RFLP) sein.
Plasmide sind kleine, zirkuläre DNA-Moleküle die sich unabhängig von Genom einer Bakterienzelle replizieren können. Sie kommen meist in mehreren Kopien vor und eignen sich daher als Vektoren für die Klonierung.
Kurze DNA oder RNA-Oligonukleotide mit bekannter Sequenz. Sie werden benötigt um nach einer Hybridisierung mit einem DNA-Fragment als Replikationsursprung für den DNA-Polymerase-Komplex zu dienen. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist z.B. auf das Vorhandensein von komplementären Primern zur Amplifizierung von DNA angewiesen.
Repetetive DNA Elemente sind nicht-codierende Sequenzen die sich im Genom mehrfach hintereinander wiederholen. Zu repetetiven Elementen gehören variable number tandem repeats (VNTR) und short tandem repeats (STR). Sie können als DNA-Marker funktionieren oder zur Erstellung eines genetischen Fingerabdrucks verwendet werden.
Der Replikationsstartpunkt oder origin of replication (ori) ist eine Sequenz in einem Genom, die als Startpunkt für die Replikation eines DNA-Moleküls dient. Vektoren wie z.B. Plasmide oder Phagen verfügen über einen ori um Ihre Replikation in der Wirtszelle sicher zu stellen.
Der Verdau von DNA-Sequenzen mit einem oder mehreren unterschiedlichen Restriktionsenzymen resultiert in einem charakteristischen Gemisch von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Länge. Durch Mutationen, die Restriktionsstellen verschieben oder Erkennungssequenzen für Restriktionsenzyme verändern kann dieses Fragment-Gemisch von einer Vergleichsprobe abweichen. Dies kann zur Erstellung von genetischen Fingerabdrücken oder zur Aufklärung von Verwandtschaftsbeziehungen genutzt werden.
Southern Blot ist ein Verfahren zum Nachweis von DNA-Sequenzen in einem Gemisch von DNA.
Ablauf: